旷场实验中的实验流程是什么？有哪些测试指标和注意事项

旷场实验主要用于焦虑模型中的神经生物学基础研究，以及新型药物和抗焦虑化合物的筛选。旷场实验一般由50*50*40的亚克力板搭建而成，并使用一个摄像机，用来检测动物在旷场箱四周及中央区的运动轨迹。本文主要介绍用于旷场实验实施过程中评估老鼠自发活动以及焦虑行为的一些规则。

一 、介绍

据调查，在2021年，焦虑症的全球患病率估计已达到了3.6%。虽然各国的调查方法存在相当大的差异，但是据世界卫生组织统计，全世界有超过3.5亿人受抑郁症困扰，已成为世界第四大疾病，而且还在快速增长中。WHO预测2030年抑郁症将成为全球疾病负担第一位的疾病。因此，如何更多的了解焦虑相关疾病，预防焦虑症，并发展新的有效的治疗方法势在必行。

旷场实验主要用于分析老鼠的的自发行为、焦虑行为以及精细行为，如理毛、修饰、站立、蜷缩等等。旷场箱一般由一般由50*50*40的亚克力板搭建而成，并使用一个摄像机，用来检测动物在旷场箱四周及中央区的运动轨迹。老鼠运动的变化过程可以表明老鼠神经系统过程的改变，并可能反应老鼠脑功能的异常。

此外，该测试可用于评估动物的总体健康状况。不健康的动物往往行动较少在中央区活动。压力较大或者较为焦虑的小鼠在旷场中表现出较少的活动，并增加的刻板行为，包括那些重复的、不变的和看似没有的目的，喜欢靠近墙壁并贴壁行走的老鼠，很明显有焦虑样行为的迹象。而焦虑较低的小鼠倾向于花更多的时间在箱子的中央区域（图2)。而应该强调的是，在衡量焦虑方面，测试结果不应被过度解读，应与其他类似焦虑行为的测试结果进行比较，例如高架十字迷宫和明/暗箱。

图1：压力较大或者较为焦虑的小鼠的活动轨迹

图2：焦虑较低的小鼠的活动轨迹

二 实验材料

1、测试/模型老鼠

2、旷场由白色/黑色的亚克力板组成，规格为50*50*40mm. 黑鼠一般用白色箱体，白鼠用黑色箱体。

3、顶部一般需要柔光照射

4、安装在旷场支架上的一个摄像头

5、浓度为70%的乙醇喷雾瓶

三、实验流程

1.将摄像机固定在旷场箱上方的支架上。

2. 通过USB或以及视频线将相机连接到计算机

3. 在测试前通过喷涂确保盒子清洁，并用70%乙醇和纸巾擦拭。

4.在实验前7天或更长时间使小鼠适应环保，并熟悉实验人员。

5.指定试验动物在实验之前，称重并记录体重。

6. 测试前一小时，让指定的老鼠进入实验室适应环境。

7. 打开软件并打开实时视频。

8. 从鼠笼中取出实验老鼠并放在旷场箱的中心区域。

9.实验人员应离开旷场箱周围以免干扰到老鼠。

10.用软件开始分析，并按自己的课题让老鼠在旷场箱里自由活动5/10/15分钟。

软件实时记录老鼠的行为活动以及相应时间

11.停止分析并保存录像，软件可以自动实时分析并保存实验数据。

12.将老鼠从旷场箱中移出并放回鼠笼。

13.在进行下一只动物的实验之前，用70%的乙醇和纸巾或者布片清洁整个旷场箱区域。

四、注意事项

1.试验和对照小鼠的品系和性质由实验者确定。通常也包括一些先前的导致焦虑样症状的条件反射。

2.Visutrack 是一个用于动物行为分析的软件，可用于分析旷场实验的实时数据。能够分析老鼠运动的总距离，进入中央区域和四周区域的次数，在中心区域和四周区域各自花费的时间，以及在这两个区域的运动速度。

3. 相机高度应当正好覆盖整个旷场箱，不宜过高或过低，过高则老鼠图像太小导致捕捉不到图像,过低则不能捕捉到老鼠的整个运动范围。

4.每只动物实验前一定要用乙醇消除气味，以免对下一只动物造成影响。

5. 实验室尽可能的保持安静，在能观察到实验的情况下，尽量避免实验动物受到干扰，以减少实验动物的心理压力。

6.使用软件分析实验时，确保软件里的相机画面可以看到整个旷场箱，否则实验数据作废。

7.在实验开始之前，需保持箱子的完全干燥。

8.在实验开始前24小时，不要对动物进行采血。在整个实验过程中，实验室应保持较低的环境噪声。

9.为便于识别，老鼠和鼠笼应进行编号。

10.实验前需要对实验动物每天抚摸1-2min以减少非特异性应激刺激对实验动物检测中的影响。

11.非常重要的一点，实验过程中操作人员不要在旷场箱周围走动，以较少老鼠的外部潜在影响。

12.低焦虑的实验动物进入中央区的频率较高，运动速度会更快。

13.总运动距离的变化在某种程度上可反应出神经系统过程的变化，以及运动障碍以及焦虑行为的变化。

五、实验指标

区域的划分：区域通常分为四角、四周及中央区域，软件自动统计这些区域内实验动物的活动路程、滞留时间及进入次数、平均速度；这里需要注意，关于区域的划分有很多不同的方式，也有很多实验者将箱体底部划分成9宫格、16宫格或者25宫格。

总路程：可进一步划分为中央格路程和周围格 路程，反映鼠的活动能力。鼠在新环境中是由紧张、兴奋、探索再到适应的一系列过程，处于兴奋状 态的小鼠表现为行动活跃，四处走动，总路程增加。 当小鼠处于抑郁状态时，其运动路程明显缩短，但总路程过长反映鼠对新环境的恐惧。值得注意的是，学习和记忆能力受损不会引起与小鼠运动能力相关的参数变化 ，亦不会导致旷场实验中焦虑行为的产生。

运动时间：指鼠在旷场实验中运动的总时间， 分为中央格运动时间和周围格运动时间。

静止时间：指视频分析系统根据人为设定的不 动阈值所计算出的动物完全静止的时间。静止时间反映动物的焦虑水平和运动能力，静止时间越长说明动物焦虑程度越高，抑郁程度越高，运动能力 越差。小鼠较差的运动能力和较长的静止时间 是抑郁的表现 ；另有研究指出静止时间反映小鼠 对周围环境的好奇心，静止时间越短，小鼠好奇心越强。

平均速度：鼠在旷场实验中运动总路程和时间的比值，可表示鼠的自主运动能力。

跨格次数：又称水平得分，跨格一次是指鼠四 足均进入相邻方格范围内[34] ，分为中央格跨格次数 和周围格跨格次数。有研究单纯应用跨格次数这 一指标来反映大鼠的活动能力 。跨格次数的多少反映鼠的自发活动程度及兴奋程度，大鼠出现抑郁时跨格次数减少。

中央格跨格次数：单纯指动物进出中央格的次数。对于中央格的界定目前主要有两种方法，一种 将与旷场反应箱壁相连的方格或者区域称为周围 格，不与反应箱壁连接的区域称为中央格 ；另一种将中央格定义为与反应箱壁有一段距离的区域， 至于这段距离的长度可根据试验设计具体设定。 以上两种方法中，第1种方法较为常用。中央格跨 格次数减少与小鼠焦虑状态相关。

中央格停留时间和中央格停留时间百分比：鼠被放于中央格后至其四足均离开中央格时的这一 时间段和这一时间段占旷场实验时间的比值即为 中央格停留时间和中央格停留时间百分比。啮齿 类动物在空间活动时会本能避开中央区域，沿着边 缘区域活动，理论上当鼠的认知能力受到影响时会 导致其中央区域停留时间延长。Yadav 等 指出， 如果动物对新环境的认知能力差，则中央格停留时间延长。然而,有研究认为中央格停留时间的减少说明动物具有焦虑行为 。中央格停留时间与鼠对周围环境的好奇度呈反比。

中央格运动时间和中央格运动时间百分比：指 整个旷场实验中鼠在中央格运动的总时间以及其 所占旷场实验时间的百分比。中央格运动时间增 加与鼠的探索行为密切相关，中央格运动时间/中 央格运动时间百分比降低是鼠焦虑的表现。

周围格运动时间和周围格运动时间百分比：整个旷场实验中鼠在周围格运动的总时间以及其所 占旷场实验时间的百分比。研究发现鼠在旷场中 央运动的时间增加，以及从周边到中央潜伏期（将动物放入周围格，动物从周围格进入到中央格的时 间）的缩短是焦虑的表现。

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